![天津百奥医药科技有限公司](https://www.bestopcell.com/uploadfile/2024/0423/20240423133406837.png)
感染性疾病一直备受临床关注。新型冠状病毒肺炎全球大流行,给世界经济和人类健康带来严峻挑战,更让病原的精准快速检测成为关注的热点。宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing,mNGS)在感染性疾病临床诊断圈子里的热度也不断上升。
病原微生物检测意义和现状
基于二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术或称高通量测序技术的宏基因组学(Metagenomics)是新近发展起来的一种快速、高效、无偏倚地获得核酸序列信息的技术,自2014年在新英格兰医学杂志上首次报道一例用二代测序技术诊断钩端螺旋体感染的病例以来,其诊断价值已迅速被认可。
mNGS 可对提取到的样本中的所有微生物的遗传序列进行检测,并与数据库中的病原菌特异性基因序列进行对比,最后鉴定出一系列可能的感染菌群。其可检测的对象包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体及寄生虫等,对罕见的病原菌感染的判断较常规培养检测具有突出的优势。
实验流程
病原微生物高通量检测过程主要包括实验操作和生信分析两部分,实验操作主要包括样本前处理、核酸抽提、文库构建和上机测序。生信分析环节主要包括数据质控、人源序列去除、微生物物种比对鉴定、耐药基因与毒力基因分析等步骤。
mNGS检测流程图(GuW et al. Annu Rev Pathol-Mech .2019. 14(1), 319)
生物信息分析
生物信息学分析是mNGS的病原微生物检测的最后环节,能够快速准确地鉴定病原微生物。但在生信分析过程中也可能引入错误,导致假阴性或假阳性结果。首先应通过每个样本的测序数据量(至少10 Mb)和序列质量(Q20/Q30)进行整体评估。随后一般利用Trimomatica或Fastp软件去除接头、低质量序列、低复杂度序列以及短读长序列,获得可以用于下游分析的高质量序列。临床病原微生物检测过程中普遍存在人源核酸污染,因此人源背景去除也是生信分析流程中重要的一步,在这个过程中也可以去除噬菌体、质粒以及工程菌等干扰序列。
在临床诊断中的应用
感染性疾病是世界范围内人类发病和死亡的主要原因。多种类型的微生物可能导致临床上复杂的感染性疾病,而传统方法能够识别的病原体谱相对较窄,这为快速、准确诊断病原带来巨大的挑战。传统的培养、血清学检测以及核酸扩增检测存在耗时、易漏检等缺陷,这很容易造成临床上的漏诊或误诊,进而导致经验性广谱抗生素的滥用。相比之下,mNGS能直接从各种临床标本中快速、准确、全面识别细菌、真菌、病毒和寄生虫。尤其在鉴定分枝杆菌、厌氧菌、非典型病原体和病毒等类群方面明显优于培养方法。
mNGS可广泛用于识别血流感染、中枢神经系统感染、呼吸道感染、骨和关节感染、尿路感染、消化系统感染等不同系统感染的病原体;有助于快速、准确的识别肺部感染病原体,特别是有助于危重患者和混合感染患者的诊疗。对于呼吸道感染性疾病来说,mNGS对苛养菌(如结核/非结核分枝杆菌、诺卡菌、放线菌、厌氧菌等)、病毒等的检测灵敏度优于或不劣于传统检测方法。
挑战及发展方向
尽管mNGS在感染性疾病诊断方面发挥了巨大的作用,但目前仍有一些技术上的难题亟需攻克:
1)如何将人源宿主核酸的影响降至最低?
去除宿主DNA和富集病原微生物的方法主要包括以下两类:(1)基于宿主细胞和微生物细胞大小的差异去除宿主细胞,如离心法和过滤法;(2)选择性裂解宿主细胞,然后用酶或化学试剂处理去除暴露的DNA。
2)如何提升胞内微生物和真菌的检测效率?
mNGS对真菌和结核等胞内细菌的检测效率低于其他微生物。因此,有效裂解真菌和胞内细菌的细胞壁有助于提高检测效率。目前用于细胞壁破壁的方法主要包括物理破壁(加温、酶消化)、机械破壁(超声波、磁珠)、化学破壁。
3)如何进行耐药基因和毒力基因的有效检测?
目前,二代测序读长短、产生的有效测序量(非人源)不足、以及耐药机制复杂多样等特点阻碍了宏基因组二代测序在耐药基因和毒力基因检测中的应用。同时,第三代测序技术的长读长、高通量、实时测序的特点决定了其在耐药基因与毒力基因检测领域应用的广阔前景。
4)更全面、更完整的数据库有助于微生物注释,针对微生物数据库的选择需要考虑以下因素:
i) 罕见病原体或新出现的病原体菌株的参考序列不完整;
ii) 参考数据库具有物种偏好性;
iii)病原体的遗传相似性等。
除此之外,检测流程的标准化,例如标本的采集和储存、核酸序列的提取与污染物的处理、核酸序列数据库的合理选取、高效且准确的生物信息学处理;更短的周转时间、更高的检测灵敏度、更低的检测费用等,也是随着测序技术的发展,需要一步一步解决的问题。
总之,宏基因组测序技术的出现是临床检测技术堪称革命性的进步,但是其发展及应用推广的证据支持仍有许多不足,期待更多临床验证证据能进一步推动临床应用指南等标准化规范的制定。
连彩 | 文案
关于百奥益康
北京百奥益康医药科技有限公司(以下简称“百奥益康”)是天津百奥医药科技有限公司的全资子公司,公司由资深的单细胞高通量测序技术科学家团队创立,致力于打造中国先进的肿瘤单细胞诊疗品牌,为科研和临床提供单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等全套解决方案,高效赋能肿瘤个体化诊疗。
百奥益康是国内为数不多实现“研发+市场”自主大幅增长的落地团队。公司管理团队、技术团队和营销团队有丰富的单细胞领域服务和研发经验,曾成功领导打造了国内领先的单细胞科研服务团队,与10X Genomics、BD、MissionBio等国际领先的单细胞平台公司有深入合作,对单细胞检测相关技术、产品、应用有深厚积淀。
依托配置合理、经验丰富的科学家团队,百奥益康实现了单细胞测序技术创新发展,能更加快捷、稳定地完成从样本处理、高通量单细胞分离、测序文库构建,到数据分析和临床意义挖掘等单细胞关键技术流程,提供涵盖单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等在内的完整技术解决方案。
公司位于北京经济开发区宏达利德园区
主营业务
百奥益康科研服务以单细胞服务为主体,配以其他以高通量测序和芯片为基础的多组学服务,提供一站式的科研服务,从而实现从单细胞水平到bulk水平系统完整的解决方案。
联系我们
咨询测序相关服务,请扫描二维码
我们将本着专业、认真、诚信及热诚的态度
向您提供我们的服务!
地址:北京经济技术开发区宏达南路5号3层
电话:15201658362
邮箱:info@bestopmed.com